1. 实验材料：

生长良好的iNKT细胞（效应细胞）、K562（靶细胞）

2. 实验仪器及耗材：

二级生物安全柜、二氧化碳培养箱、医用冷藏冷冻箱、高速离心机、自动细胞计数仪、声波聚焦流式细胞仪、倒置显微镜、96孔U底板、无菌离心管及无菌移液管等。

3. 实验试剂：

4. 操作步骤：

4.1 配制预保存液：

1. 在CellTrace Violet冻干粉中加50 μL 二甲基亚砜（DMSO），配制为2 mM的Cell CellTrace Violet母液，按照10 μL /管分装至1.5 mL EP管中，做好标记，于-20℃保存，避免反复冻融。
2. 细胞培养基配制：K562生长培养基是10%FBS的DMEM培养基。

4.2 实验操作：

1. 取出适量靶细胞，1200rpm室温离心6min，弃上清。细胞沉淀加入10mL DPBS重悬，1200rpm室温离心6min，弃上清。细胞沉淀加入1mL DPBS，1 μL CellTraceTM Violet母液，吹打混匀后，置于37℃，5% CO2培养箱孵育20min标记。
2. 孵育结束后，加入10mL PBS将靶细胞洗涤1次，1200rpm室温离心6min弃上清。用1mL iNKT完全培养基重悬沉淀，计数后稀释至2*10^5/mL，100μL/孔铺板96孔U底板。
3. 收集效应细胞，800rpm室温离心6min，弃上清，用细胞培养基（iNKT完培）重悬细胞沉淀，取样计数。
4. 根据计数结果，调整效应细胞密度并梯度稀释至合适效靶比（例：1:1/3:1/5:1等）。
5. 根据试验设计将效应细胞100μL/孔加入靶细胞中，每孔总体积为200μL。并设置只含靶细胞的孔作为对照组（对照组为100μL靶细胞+100μL iNKT完配）。
6. 将细胞置于37℃，5%CO2培养箱培养4h，流式检测。

4.2 流式检测：

7. 孵育结束后可直接进行死细胞染色，加入提前配制好的抗体稀释液（780可直接加入DMSO稀释五倍分装，每孔200μL的体积加入2μL抗体），室温避光孵育15 min（注意：对照组同样需要染色，看孵育过程中K562的自然死亡）。收集孵育结束后细胞至1.5mL EP管中，补加适量PBS，400g室温离心5min，弃上清。
8. 每个样本加入300μL PBS充分混匀后，流式细胞仪上机检测。
9. 结果计算，根据流式细胞仪检测结果，分析杀伤效率。